Личные сообщения () · Новые посты Форума · 
Главная » Статьи » Хромато-масс-спектрометрия » Для начинающих

AMDIS и работа с библиотеками для начинающих

Открыть полный текст статьи в PDF

Это – иллюстрированное руководство по работе с AMDIS и смежным вопросам. Возможно, оно настораживает своим размером. В действительности, он невелик, поскольку информативность каждого слайда (кроме некоторых, текстовых) мала из-за преобладания иллюстраций.

Если Вы – начинающий пользователь, то настоятельно рекомендую просматривать руководство, сразу же пробуя повторить излагаемое в окнах AMDIS и NIST. Руки обязательно запомнят, и появится целостное восприятие.

Если Вам обсуждаемая тема известна и понятна, то Вы можете просто – по-быстрому –  пролистать презентацию и, возможно, найдете что-либо интересное.

Если появятся какие-либо вопросы (замечания, возражения, сомнения и пр.), то мои реквизиты таковы:

[в полном тексте статьи] (могу редко заглядывать в почту, поэтому короткая смс-ка ускорит процесс)

 

С уважением – Григорьев А.М.

Содержание

3 - Примечания, аббревиатуры и сленг.

4 – Назначение и особенности AMDIS.

9 – Кратко об индексах удерживания.

11 – Начало работы с AMDIS.

13 – Поиск соединений по спектру (без учета удерживания) и общие приемы работы.

28 – Поиск соединений по спектру и индексу удерживания.

34 – Оформление отчета.

38 – Калибровка удерживания по алканам.

47 – ГХ-МС библиотеки.

48 – Комплект NIST.

56 – Поисковая библиотека AMDIS (формат .MSP).

63 – Специализированная алкановая библиотека (.CSL)

Зачем нужна AMDIS и почему не следует искать соединения обзорником.

1. Ион-хроматограммы – чрезвычайно емкий источник информации. А специфика нашей деятельности связана с биологическими образцами, которые – сами по себе – обладают богатой матрицей, причем искомого соединения в образце обычно очень немного. И потому каждый пик на хроматограмме TIC обычно не соответствует чистому веществу. Почти как правило, он представляет собой смесь соэлюирующихся соединений. И это так – несмотря на то, что капиллярные ГХ-колонки весьма эффективны. Можно добавить, что ГХ-МС система обладает собственным фоном: остаточные газы, всегда присутствующие в камере МС (компоненты воздуха – азот, кислород, вода, углекислота) плюс фон (или течь) самой ГХ колонки (пример на слайде 19). Фон усиливается при повышении температуры, что хорошо видно на градиентных хроматограммах. Значит, щелкая по пикам в обзорнике можно получить лишь загрязненные спектры (исключение составляют нечастые случаи высокой концентрации – однако, этот вариант более характерен для анализа вещественных доказательств, т.е. ФСКН или МВД, но не для нас). В результате, опознание вещества по спектру будет ненадежным или невозможным. Конечно, можно пытаться вычитать фон средствами обзорника, но такой способ пригоден лишь для постоянного (или линейно меняющегося) фона. А как же соэлюирование?

2. Исходя из п.1, можно не сомневаться в том, что ручная обработка ион-хроматограмм приведет лишь к многочисленным ложноотрицательным результатам. Да, в обзорнике есть поисковые функции, однако, их надо конфигурировать по каждому соединению. Сколько таких соединений можно занести вручную – 10, 100? Сколько времени это займет? И это будут скорее всего, нативы и/или их дериваты, но не метаболиты. А в профессиональных тематических поисковых библиотеках для AMDIS их тысячи (в известной библиотеке Maurer с соавт. – более 8500). Автоматическая обработка ион-хроматограммы занимает минуты.

3. К сожалению, масс-спектр не является абсолютно специфичной характеристикой вещества. Есть достаточно веществ с очень похожими, а есть – с весьма малохарактеристичными спектрами. Эта ситуация обычно усугубляется тем, что при малых концентрациях МС обеднен или искажен и надежное опознание, конечно же, невозможно. А значит, нужна дополнительная (и независимая от МС) характеристика вещества, и это, разумеется, удерживание. AMDIS работает и с параметрами удерживания.

4. Но – пользоваться просто временем удерживания – крайне неудобно. Ведь оно изменится при смене колонки (у них, вообще-то, разная длина – трудно 30-метровой трубке и слою фазы в ней придать точные размеры, да ее еще и подрезают при установке в ГХ-МС). А также при обрезке начального участка после загрязнения, при старении и общем загрязнении. Значит, измерять удерживание надо в каких-то относительных величинах. Без дополнительной аргументации (хотя предоставлю ее при запросе), полагаю оптимальной систему алкановых индексов: кстати, ее возраст исчисляется десятилетиями, и это – сложившийся стандарт измерения удерживания в ГХ. AMDIS органично предназначена для работы с индексами, а один из результатов ее работы – численная характеристика качества идентификации, основанная как на масс-спектре, так и на удерживании.

5. Для чего же тогда нужен обзорник? У него достаточно своих функций. Рассматривать хроматограммы, накладывать их, сравнивать, проводить количественный анализ и пр.

 

Чего не может делать AMDIS.

То, что описано в п. 5 на предыдущем слайде.

1. В AMDIS загружается только одна хроматограмма, и это правильно. Вообще, AMDIS (теоретически) может работать с несколькими хроматограммами в отдельных окнах, но этот режим крайне ненадежен.

2. AMDIS вычисляет площади пиков, но эта функция, скорее, имеет подчиненный (дополнительный) смысл. В качестве интегратора использовать ее не надо.

3. Важно! Разумеется, AMDIS способна идентифицировать только те соединения, чьи характеристики указаны в применяемой поисковой библиотеке (просто иногда об этом забывают).

Что делает AMDIS.

Все процедуры описать не смогу; думаю, создатели AMDIS их (в полном объеме) тоже не знают/забыли. Но кратко:

1. Обнаруживает соединения на хроматограмме.

2. Получает очищенные масс-спектры для каждого соединения. Для этого существуют соответствующие математические процедуры (деконволюция).

3. Определяет индексы удерживания (если такая задача поставлена).

4. Идентифицирует найденные соединения на основании их очищенных спектров и индексов удерживания и характеризует качество идентификации.

5. При запросе – печатает отчет.

Почему именно AMDIS.

1. AMDIS – бесплатная программа, распространяемая американским национальным Институтом стандартов и поэтому прекрасно совместима с остальной продукцией NIST. И это – в ситуации, когда производители ГХ-МС оборудования увлечены конкурентной борьбой и поэтому не заинтересованы в совместимости.

2. По крайней мере, мне неизвестны какие-либо аналоги AMDIS.

Не так давно меня попросили обратить внимание на некую возможную замену AMDIS: этот программный продукт  с (якобы) подобной функциональностью был опубликован на одном из англоязычных тематических сайтов Интернет.  Продукт оказался платным, и сайт предлагал оценить триальную (временную) версию. Экспертиза сего творения продолжалась недолго и привела к выводу о том, что его создателям предстоит длительный и упорный трудовой путь, в конце которого – может быть и когда-нибудь – они смогут хотя бы предложить испытать его результаты. Однако, эти люди хотели денег – и сразу.

Возможно, кто-либо действительно укажет на возможную замену AMDIS, и я буду рад ею воспользоваться. Но те люди – за сайтом – скорее, были похожи на мошенников.

3. Некоторые алгоритмы AMDIS реализованы в последних версиях аджилентовского пакета MassHunter (так указано в описании). К сожалению, знакомство с этой реализацией только подпортило настроение: она крайне неудобна и нетороплива.

Как AMDIS обнаруживает соединения на хроматограмме.

Допустим, что имеется хроматограмма, зарегистрированная в режиме SCAN в обычном диапазоне – например, от 45 до 600 m/z. Это значит, что в действительности масс-спектрометр регистрировал 556 независимых ион-хроматограмм (600 – 45 + 1 = 556). Их сумма (по ординате) – это еще одна хроматограмма (TIC).

AMDIS просматривает каждую ионную хроматограмму и ищет хроматографические пики на ней. Каждый пик интегрируется: определяются времена его начала, конца и максимума.

Рассмотрим пример (пять ион-хроматограмм и их сумма – TIC). Допустим (для упрощения) что все остальные ион-хроматограммы пусты.

Пики 1 и 2 образованы, вроде бы, только одним ионом – 73. Однако – если приглядеться – то на хроматограммах 149 и 275 видны небольшие горбики, близкие по удерживанию к пикам на хроматограмме 73. AMDIS придется вынести решение, считать ли эти «горбики» пиками или шумом . В первом случае масс-спектры веществ 1 и 2 будут состоять из интенсивного иона m/z 73 и малоинтенсивных  149 и 275, во втором - только из одного иона (73). Для вынесения такого решения AMDIS оценит уровень шумов для каждой ион-хроматограммы.

Как AMDIS обнаруживает соединения на хроматограмме (продолжение).

Пик 4 имеет почти одинаковое время максимума на ион-хроматограммах m/z 73 и 383. А что значит «почти»? Вот здесь AMDIS придется принять решение о том, считать эти пики принадлежащим одному веществу, или нет. Такое решение будет принято на основании ряда математических алгоритмов обработки – и, разумеется, настроек AMDIS. Смена настроек приведет к разным решениям, и какое решение наиболее правдоподобно – решать оператору. Об этом далее.

Пик 5 почти не виден на хроматограмме TIC, но отчетлив на 383. Скорее всего, его спектр будет состоять из одного иона – 383.

А вот следующий пик на хроматограмме TIC образован, как минимум, двумя соединениями - 6 и 7, причем это видно только на ионных хроматограммах (но не на TIC). Это – соэлюирование. Наверное, соединение 6 характеризуется только ионом  149 (кстати, это фталат), а соединение 7 – уже тремя (73, 193, 275), и его спектр будет состоять из этих трех ионов. В данном случае AMDIS примет верное решение о наличии двух веществ и отобразит их чистые масс-спектры. А если времена максимумов пиков 6 и 7 будут еще ближе, или даже совпадут? Тогда AMDIS может посчитать их одним веществом (с масс-спектром, содержащим все ионы – 149, 73, 193, 275), и это, разумеется, будет ошибкой. Устранить такую ошибку математическими приемами невозможно, поскольку сами исходные хроматограммы – в случае совпадения - не содержат никакой информации о наличии именно двух соединений. Образец придется перекалывать в других условиях – ускоряя или замедляя градиент, или же меняя хроматографическую фазу.

Как AMDIS обнаруживает соединения на хроматограмме (окончание).

Пик 8 образован ионами 275 и 73. Однако, пик на ион-хроматограмме 73 (кстати, все это – хроматограммы триметилсилилированного образца, а ион m/z 73 обычен для спектров TMS-дериватов, и следовательно, не характеристичен) является наездником пика вещества 7. Попадет ли он в масс-спектр вещества 8, определяется настройками. Иногда решение о принадлежности таких ионов найденному веществу проще принять самостоятельно, разглядывая ион-хроматограммы. Как правило, при этом отпадают вопросы о том, почему какой-либо ион попал в спектр – или же почему его там нет.

Пики со знаком вопроса (3, 9, 10), очевидно, образованы соэлюирующимися соединениями. Это видно по их форме на TIC и m/z 73. Ионы, которые их образовали, на этой картинке отсутствуют.

Кратко об индексах удерживания.

Алкановый индекс – «всего лишь» выражение удерживания соединений относительно удерживания нормальных (неразветвленных) алканов. Значит, чтобы измерять удерживание в шкале индексов (RI), надо знать времена удерживания алканов. А AMDIS придется составить пересчетную таблицу.

Каждому алкану приписывается индекс, точно равный произведению числа метиленовых групп на 100. Так, для декана он 1000 (у декана – 10 метиленовых групп), для пентадекана (С15Н32) – 1500, и.т.д.

AMDIS рассчитывает линейный индекс , не учитывающий мертвый объем колонки и не соответствующий классическому (логарифмическому) индексу Ковача. Это объясняется неудобством использования индекса Ковача в режиме градиентной ГХ (он формулировался для изократики). Однако – в численном плане – эти величины довольно близки.

AMDIS пользуется простейшей (кусочно-ломаной) аппроксимацией, т.е. полагает, что индекс меняется линейно при переходе от одного алкана к другому. И соответствующие вычисления просты, например:

У алкана С28 (индекс 2800) удерживание 10 мин.

У С30 (индекс 3000) – 11 мин.

Значит, если у некоего интересующего нас вещества «Х» удерживание 10.5 мин, то его линейный индекс равен 2900. Для измерения индекса удерживания любого соединения необходимо, чтобы его удерживание (мин) находилось между удерживанием двух алканов.

Для корректного измерения индексов есть два требования. 1. Не следует пытаться измерить индекс вещества, удерживание которого меньше (больше) имеющегося  алканового ряда. Да, AMDIS его все равно рассчитает, но полученная величина будет неверной.

2. Крайне желательно брать смежные (по числу метиленов) алканы. Если они взяты с большой разницей между числами метиленовых звеньев (например, С20 и С30 вместо хотя бы четного ряда С20, С22, С24, …, С30), то индекс будет измерен  с недопустимо большой погрешностью.

Кратко об индексах удерживания (окончание).

Некоторые особенности поведения индексов.

1. Для разных хроматографических фаз индексы, разумеется, различны, поскольку различна их селективность. Чем полярнее фаза, тем больше индекс. Например, на распространенных слабополярных фазах, аналогичных 5% фенилметилполисилоксан (это HP-5ms, DB-5ms, Rtx-5ms и многие другие), индекс удерживания кодеина около 2416 (то есть, он выходит после алкана С24 и перед С25) . А на среднеполярной DB-17ms (аналогичной 50% фенилметилсилоксан) его значение около 3028. Кстати, поэтому колонка DB-17ms удобна для подтверждающих определений.

2. На каждой фазе индекс немного меняется при изменении температурных условий разделения. Если увеличивать температуру (или делать более крутым градиент), то индекс растет. Например, для того же кодеина (фаза HP-5ms):

градиент 100-300°С, скорость 35°/мин – около 2416;

градиент 100-280°С, скорость 15°/мин – около 2472 (кстати, в этом примере представлено весьма значительное изменение условий).

Чем соединение более полярно, тем сильнее его индекс меняется с температурой. Для TMS-дериватов это изменение обычно невелико.

Поэтому, строго говоря, надо пользоваться индексами, измеренными в тех условиях, которые приняты как рабочие. Однако, если это невозможно, то серьезных затруднений все равно нет. При первом обнаружении вещества с помощью AMDIS и поисковой библиотеки с индексами можно  пользоваться приблизительным значением, приведенным в этой библиотеке (разумеется, при условии надежного совпадения МС и при отсутствии сомнений в наличии этого вещества). И затем - откорректировать его значение.

Альтернатива №1 – пользоваться тем методом и той колонкой, для которых и была сформирована библиотека. Это – неудобно.

Альтернатива №2 – не выдавать заключений без прокола стандартного вещества. Это – нереально.

Альтернативу №3 – обойтись без учета удерживания – я не оцениваю вообще. Хотя, AMDIS вполне используема и в таком режиме.

3. Кроме индексов удерживания, в последнее время применяется еще один режим – учет удерживания с помощью фиксации времен (ФВУ – фиксация времен удерживания, или RTL – Real Time Locking). Этот режим придуман в незапамятные времена (все-таки, ГХ существует более 80 лет), но – не так давно, с совершенствованием газовых регуляторов и технологий изготовления колонок – стал продвигаться известным Agilent. Доступны соответствующие библиотеки, хотя до известных токсикологических сборок (например, сделанных Maurer с соавт.) им, конечно же, очень далеко. Я не буду сравнивать эти режимы (тема весьма широка), но отмечу: тем, кто пользуется ФВУ ничего не мешает параллельно пользоваться также индексами. Хотя бы потому, что в вашем распоряжении будет вся обширнейшая информация, накопленная хроматографистами за все время существования ГХ (в том числе – приведенная в библиотеках NIST).

Начало работы.

Загружаем хроматограмму в AMDIS. Для этого есть 2 варианта:

1. Из обзорника (Spectrum-> AMDIS)

2. В самой AMDIS (File -> Open…)

и выбираем хроматограмму. Это – каталог с расширением .D

И надо сделать важное действие.

Оно выполняется однократно, после установки самой AMDIS (и только тогда, когда загружена любая хроматограмма).

Смысл его в том, что после обработки хроматограммы AMDIS создает отчеты – 2 файла с расширениями  .ELU и .FIN и с именами, идентичными имени хроматограммы:

Они будут накапливаться в каталогах хроматограмм и мусорить.

Если это нежелательно, то правим основные опции AMDIS.

File -> Options

и делаем так:

Теперь AMDIS будет стирать отчеты при загрузке новой хроматограммы и при выходе.

А при следующем запуске будет автоматом загружать последнюю хроматограму.

Если эти отчеты зачем-то нужны, то пометьте Keep (сохранять) или Ask user (спросить). (Мне они не понадобились ни разу: проще обработать хроматограмму еще раз, это недолго, нежели вспоминать, при каких условиях создавались старые отчеты).

Поиск соединений по спектру (простой, Simple)

Если после предыдущего поиска параметры менять не надо (т.е. занимаемся рутинной работой), то после загрузки хроматограммы просто Run

Если меняем параметры поиска (и/или библиотеку), то

Analyze -> Analyze GC/MS Data…

Это вход в основное окно настроек, в нем придется бывать часто.

В Type of Analysis (а это выбор режимов работы AMDIS) выбираем Simple

Если надо, то выбираем поисковую библиотеку (Target Library)

Для этого жмем Select New… (выбрать новую).

Если надо просмотреть записи этой библиотеки, то View)

Ищем и выбираем требуемую библиотеку.

Библиотеки, использованные ранее, можно выбирать из опускающегося списка (чтобы не разыскивать их на диске) О форматах библиотек (.MSP, .MSL – далее)

И подтверждаем выбор – Save (это сохранит выбор для дальнейших работ), или отказываемся (Cancel)

Далее выставим настройки; они одинаковы для всех режимов. Если они были выставлены ранее, это действие пропускаем.

Вкладка Identif (если вкладка не видна, работаем стрелками вверху справа).

Minimum match factor – это минимальный коэффициент совпадения (в данном случае – только по спектру, поскольку удерживание в этом режиме не учитывается!). Все найденные и предположительно идентифицированные соединения, для которых эта величина получилась больше указанной, будут перечислены в списке  обнаружений.

Обычно рекомендуют величину 60. В подавляющем большинстве случаев этот выбор оптимален: список не будет слишком длинным из-за большого количества маловероятных (и, скорее всего, ложных) идентификаций . А действительно присутствующие вещества не будут пропущены.

У меня привычка указывать «40», т.к. это удобно для поиска новых (еще внесенных в поисковую библиотеку) соединений. И я привык к просмотру длинных списков.

Вкладка Instr (Инструмент). Правим ее содержимое при несоответствии рисунку.

Вкладка Deconv. (Деконволюция).

Параметр Component width (ширина компонента) важен: это примерная ширина хроматографического пика на половине высоты, и он используется при интегрировании. Для скрининговых ГХ градиентов обычно выставляется 12. Однако  (редко) на сильно зашумленных  хроматограммах AMDIS не может провести верное интегрирование и, следовательно, пропустит вещество. Если знаем, что оно на хроматограмме действительно присутствует, то этот параметр можно варьировать (обычно от 2 до 15).

Остальные параметры:  Adjacent peak subtraction (число мешающих ионов, используемых для поправок), Resolution (разрешение), Sensitivity (чувствительность), Shape requirements (требования к форме) примерно описывают сложность хроматограммы – формы пиков и соэлюирование. На примере выставлен набор этих параметров, позволяющий добиваться высокой чувствительности при обнаружении. Как правило, менять их не надо; разве что Adjacent peak subtraction можно устанавливать в 2 (если знаем, что искомое вещество может присутствовать, но AMDIS его не видит).

Вкладку Libr. (Библиотеки) уже видели – она используется при подгрузке библиотек.

Вкладка QA/QC  (Контроль качества). Здесь указываем вспомогательные параметры:

Solvent tailing («хвост» пика растворителя) – m/z иона, характеризующего растворитель вводимого образца (здесь  - этанол). Правильная установка требуется крайне редко: в случае, когда интересуют легкие соединения, выходящие на хвосте растворителя. Хотя на обычно используемой фазе (аналогичной 5% фенилметилполисилоксан) можно работать и с такими соединениями (конечно, весьма неуклюже), лучше взять другую колонку, более предназначенную для таких задач.

Column bleed (течь колонки) – m/z иона, характеризующего фон колонки – т.е., соединений, образующихся при термической деградации хроматографической фазы. Для обычно используемых фаз (HP-5ms, EVDX-5ms, DB-5ms, Rtx-5ms и прочих аналогичных 5% фенилметилполисилоксан) это 207 (фоновый спектр HP-5ms на следующем слайде)


 

Пример фона колонки HP-5ms

 

Остальные вкладки несущественны. Далее жмем Save (параметры будут записаны в инициализационный файл) и Run

Run – запуск обработки хроматограммы (та же, команда, что и на слайде  13).

Время обработки определяется размером поисковой библиотеки, сложностью и длиной хроматограммы и, разумеется, компьютером. Так, долго обрабатываются хроматограммы силилированных образцов (они весьма сложны).

Если при записи хроматограммы был убран (или сильно снижен) параметр Treshold (это порог шумов), то обработка будет очень долгой, хотя, иногда и более продуктивной).

 

Рабочие окна AMDIS (так они названы в описании)

Окна AMDIS  можно убирать и восстанавливать (в зависимости от предпочтений и размера монитора.

Всего их 4 (неподвижных) и одно (список обнаруженных соединений) – перемещаемое.

Для этого: View -> Show Window… и правим пометки.

 

 

ионные хроматограммы

профиль компонента

скан

библиотека

 

 

При первом запуске AMDIS окно-список фиксировано (и видно только тогда, когда включено окно Component Profile!!), см. предыдущий слайд.

Его лучше сделать подвижным.

ПК по правому верхнему полю окна и выбираем Undock

Теперь его можно перетащить куда угодно. У окна 4 поля, а их размер меняем только со стороны каждого поля (в отличие от обычных окон Windows)

Содержимое любого окна растягиваем ЛК (это можно делать по ступеням, последовательно). Сброс растяжки – ПК и Unzoom (ступенчатый сброс) или Unzoom All (полный сброс)

При выборе соединения, для которого выполнена идентификация, индицируются спектры (их – четыре)

При выборе неидентифицированного соединения, разумеется,  индицируются только 2 верхних спектра.

Посредством ПК (и далее выбор Nist Library -> Go to NIST MS Program) спектр можно переслать в оболочку NIST для опознания.

Белый пунктир – Uncertain (незначимые) ионы. AMDIS не уверена, что они действительно принадлежат очищенному спектру, и поэтому не обрабатывает их (хотя обращает внимание хроматографиста на их возможное наличие). Их можно показывать или спрятать (ПК по окну спектра и пометить или убрать пометку Show Uncertain Peaks). Эти ионы не пересылаются в NIST, хотя такую пересылку можно организовать, выбрав  в основном окне AMDIS «Analyze -> Use Uncertain Peaks»

Наверх

Продолжение - в полном тексте статьи в PDF



Источник: /Articles/AMDIS_Grigoriev.pdf
Категория: Для начинающих | Добавил: Alexlp (26.12.2017) | Автор: Григорьев А.М. E-mail
Просмотров: 3106 | Комментарии: 1 | Рейтинг: 5.0/2
Всего комментариев: 1
avatar
1
Прекрасная статья! Компактно и просто. Тезисный тип изложения очень удачно выбран. Как хорошо что нашелся наконец-то человек который всё это описал. Для новичков особенно актуально...
нашел опечатку не важную конечно но все же:

Пик 5 почти не виден на хроматограмме TIC, но отчетлив на 383. Скорее всего, его спектр будет состоять из одного иона – 373.
avatar